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蔡司掃描電鏡植物葉片樣品處理方法發(fā)布日期：2023-01-11 10:26:55
它是葉類植物的主要營養(yǎng)器官之一，對植物葉片的觀察對植物種類的鑒定起著非常重要的作用。植物的葉表皮特征具有一定的遺傳穩(wěn)定性，葉表皮的微形態(tài)特征也能在一定程度上反映類群間的親緣關(guān)系。
目前，應(yīng)用蔡司掃描電鏡觀察植物的精細(xì)結(jié)構(gòu)特征已成為植物學(xué)研究的重要手段之一，但這些植物樣品中普遍含有水分。對于含水量較低的植物樣品，通常只需通過表面清潔、樣品貼在樣品臺上等簡單過程即可進(jìn)行觀察。但是，如果直接觀察含水量高的植物樣品，在蔡司掃描電鏡的真空管中會造成很多不良后果:
①樣品經(jīng)電子束轟擊后，蒸發(fā)的水蒸氣遇到高能電子流，發(fā)生電離放電，產(chǎn)生較大波動，使圖像模糊，起霧，或根本不成像；
②大部分樣品在高真空下容易發(fā)生形態(tài)損傷，使研究特征收縮變形；
③物鏡、鏡頭、光圈污染；④燈絲遇水蒸氣氧化、變質(zhì)，甚至熔斷。
雖然近年來出現(xiàn)了可以觀察含水樣品的蔡司掃描電子顯微鏡，但上述觀察方法的分辨率較低。因此，目前無水樣品的掃描電鏡被廣泛應(yīng)用。因此，要獲得良好的蔡司掃描電鏡觀察效果，制樣方法是關(guān)鍵，一般需要固定、脫水、更換、干燥。本文對掃描電鏡制樣過程中植物葉片的固定、脫水、置換和干燥的不同研究方法進(jìn)行了總結(jié)和比較，以期為相關(guān)研究提供參考。
固定的；不變的目前有戊二醛、FAA、鋨酸、卡諾固定劑、甲醇等。廣泛用于固定植物葉片。對于一些容易固定或不易變形的材料，為了降低實驗成本，可以使用戊二醛進(jìn)行固定。固定溶液濃度的選擇很大程度上取決于葉子樣品的含水量和嫩度。用過低或過高濃度的戊二醛溶液(4℃固定4 h)處理嫩葉和含水量高的葉片時，大部分葉片失水嚴(yán)重，導(dǎo)致表面形態(tài)觀察不清。選擇合適的濃度進(jìn)行固定處理，觀察效果比較好，葉細(xì)胞形態(tài)比較飽滿。
脫水
對于植物葉片樣品的脫水置換處理，常用的方法是在每個濃度下用梯度乙醇溶液脫水15 min，然后用叔丁醇置換100%乙醇。室溫下，先用乙醇-叔丁醇溶液20 min，再用100%叔丁醇30min，再用100%叔丁醇反復(fù)置換一次。置換過程中省略了乙醇-叔丁醇溶液的處理，直接用100%叔丁醇置換三次即可獲得理想的結(jié)果。此外，在脫水前，研究人員可以使用所選固定劑對應(yīng)的緩沖溶液進(jìn)行反復(fù)清洗，以去除固定劑，防止戊二醛與鋨酸反應(yīng)或防止戊二醛與脫水劑(乙醇、叔丁醇)反應(yīng)，導(dǎo)致沉淀，影響固定化效果。
干燥的
樣品的干燥方法有多種，如自然干燥、烘箱干燥、臨界點干燥、叔丁醇真空干燥和冷凍干燥。自然干燥法一般可用于含水量低、細(xì)胞壁厚、蠟質(zhì)層厚的植物葉片或老葉，操作簡便。干燥法適用于堅硬耐熱的植物葉片，如被子植物葉片。臨界點干燥法和叔丁醇真空干燥法幾乎適用于各種植物樣品，但考慮到操作的復(fù)雜性，當(dāng)可以采用更簡單的干燥方法時，一般不選用。冷凍干燥法能反映樣品真實的微形態(tài)特征，但冷凍干燥過程中冷凍和脫水脅迫會對植物葉片造成損傷。需要掌握最佳的凍干溫度和時間，適合水分較多的幼葉。
本文將水稻、小麥、花生的葉片用4%戊二醛溶液固定2小時，再用30~100%梯度乙醇脫水(每個濃度15分鐘)，再用100%叔丁醇反復(fù)置換3次(每次30分鐘)，最后自然風(fēng)干。葉子曬干后，樣品噴金，然后在掃描電鏡下觀察。
圖3顯示了蔡司臺式掃描電子顯微鏡下的葉片形態(tài)。圖(a)和(b)顯示了水稻葉的表面形態(tài)，圖(c)和(d)顯示了小麥葉的表面形態(tài)，圖(e)和(f)顯示了花生葉的表面形態(tài)。在蔡司掃描電鏡下，處理后的葉片可獲得良好的微形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)良好，邊界清晰，氣孔形態(tài)正常，但仍有輕微收縮現(xiàn)象。目前無論用什么方法對掃描電鏡樣品進(jìn)行預(yù)處理，都不能完全避免細(xì)胞皺縮、膨脹等變形，也沒有一種掃描電鏡處理和觀察方法可以適用于所有類型的植物葉片，只能達(dá)到一種相對理想的狀態(tài)。為了取得更好的效果，我們需要在未來不斷探索。